引用本文： 黃蓉, 葉藍藍, 鄧晶, 周傳東. 超聲彈性成像聯合細針抽吸洗脫液中肌動蛋白絲相關蛋白1反義RNA1 檢測對甲狀腺結節的診斷價值. 中國普外基礎與臨床雜志, 2023, 30(9): 1098-1103. doi: 10.7507/1007-9424.202303032 復制
甲狀腺結節患病率高達70%左右，盡管大部分甲狀腺結節是良性，但是仍有10%～15%為惡性[1]。目前甲狀腺結節主要通過甲狀腺影像報告與數據系統（thyroid imaging reporting and data system，TI-RADS）進行風險預測。然而在基于常規二維超聲檢查的TI-RADS中，非典型良性和惡性甲狀腺結節的特征可能重疊，尤其是TI-RADS 3類和4類結節，其特異性和準確性不高。細針抽吸（fine-needle aspiration，FNA）活檢被認為是目前判斷甲狀腺病變良惡性的最有效方法。然而由于FNA組織量較少，仍存在一定的誤診率[2]。因此，仍需探索方便、準確及有效的評估方法。超聲彈性成像（ultrasound elastography，USE ）可用于鑒別甲狀腺結節良惡性，其原理是基于組織硬度由其基質結構性質決定，病理變化如腫瘤或炎癥會改變組織成分和結構，增加病變硬度。相關指南[3]已推薦將USE作為甲狀腺結節的一線評估手段。肌動蛋白絲相關蛋白1反義RNA1（actin filament associated protein 1 anti-sense RNA1，AFAP1-AS1）是一種致癌的長鏈非編碼RNA，在多種惡性腫瘤中異常上調，其上調與惡性腫瘤的某些臨床病理特征關系密切[4-5]，它在甲狀腺癌組織中也較在正常組織中表達明顯升高[6-7]。目前臨床上有通過對病灶進行FNA洗脫液中甲狀腺球蛋白檢測能夠有效提高診斷準確率的研究報道[8-10]。然而目前尚缺乏USE 聯合FNA洗脫液中AFAP1-AS1來鑒別良惡性甲狀腺結節的報道。本研究以甲狀腺結節術后病理結果作為評估甲狀腺結節良惡性的金標準，分析USE 聯合FNA洗脫液中AFAP1-AS1診斷甲狀腺惡性結節中的準確性、敏感度和特異度。
1 資料與方法
1.1 研究對象的納入和排除標準
回顧性收集2020年1月至2022年6月期間在深圳市福田區第二人民醫院（簡稱“我院” ）接受診治且符合本研究納入標準的甲狀腺結節患者作為研究對象。患者納入標準：① 均接受甲狀腺切除術，且在術前同時接受了USE檢查和FNA活檢洗脫液中AFAP1-AS1 mRNA檢查；② 所有入選患者年齡均 ≥18歲；③ 術前甲狀腺結節未接受過任何治療。排除標準：① 排除伴血液系統疾病和嚴重心腦血管疾病患者；② 有其他腫瘤病史。該項研究遵循了世界醫學會赫爾辛基宣言，獲得了我院倫理委員會的批準。所有納入患者每次診斷檢查和治療程序以及本研究發表時均知情同意并自愿簽署知情同意書。
1.2 USE檢查
1.2.1 儀器設備
采用AplioTM 500彩色多普勒超聲診斷系統（日本東芝公司）對甲狀腺結節進行檢查。規格：線陣探頭，探頭頻率4.8～11.0 MHz，具備USE檢查和和軟件分析功能。
1.2.2 檢查方法
由具有5年以上USE檢查和診斷經驗的同一超聲醫生進行。被檢查對象平躺仰臥于檢查床上，充分暴露頸部檢測區域。在USE檢查之前進行二維超聲（尺寸和實質回聲）評估。在機器的彈性成像系統激活后，通過徒手技術對目標區域上方的皮膚進行重復光壓縮來獲得圖像施加壓力時探針垂直于皮膚，避免橫向移動。通過影像存儲記憶對采集的圖像進行評估，進而對壓縮和減壓過程中目標病變處發生的彈性變化進行回顧性評估。根據影像資料確定靶病灶的理想壓力。彈性圖顯示靶病灶區域顏色范圍從紅色（對于彈性應變最大的靶病灶組織部位即表示硬度最軟）到藍色（對于無應變的靶病灶組織部位即表示硬度最硬）。經過7～8次壓縮—松弛循環后，完成彈性成像檢查。
1.2.3 甲狀腺結節硬度USE評分
采用5分法Rago標準[11]：整個結節區域彈性良好，彈性成像顯示為綠色評為1分；結節大部分區域有彈性，彈性成像顯示為藍綠相間分布，以綠色為主評為2分；僅在結節的外圍部分區域有彈性，彈性成像顯示為結節中心區域藍色，周邊為綠色，兩種顏色所占區域比例相近評為3分；結節內無彈性，彈性成像顯示結節整體呈藍色，伴有少許綠色評為4分；結節及周邊組織區域均無彈性，彈性成像顯示這些區域均呈藍色評為5分。診斷標準：1～3分者診斷為良性，4～5分者則診斷為惡性。
1.3 FNA洗脫液中AFAP1-AS1 mRNA檢測
1.3.1 FNA洗脫液制備
手術前患者仰臥位，通過超聲掃描并定位目標結節，選擇FNA路徑。穿刺針為日本八光HAKKO公司生產的23G或25G穿刺針。穿刺部位皮膚進行消毒和局部浸潤麻醉。經超聲引導，針尖在沒有負壓的情況下進入結節內并經過3～4次抽吸，生理鹽水反復沖洗穿刺針，制成洗脫液儲存在–80 ℃條件下待下一步研究。
1.3.2 AFAP1-AS1 mRNA檢測
使用TRIzol試劑盒（美國Invitrogen公司）進行FNA洗脫液樣品的RNA提取。使用NanoDrop微量分光光度計（美國Invitrogen公司）測定RNA的數量和質量，并將RNA儲存在–80 ℃條件下。使用逆轉錄試劑盒（美國Invitrogen公司）將RNA反轉錄成cDNA。構建50 μL反應體系：總RNA 40 μg，10×DNase Ⅰ buffer 5 μL，RNase Inhibitor 20 U，DNaseⅠ（RNase-free） 2 μL（10 U），加入RNase-free dH2O至總體積50 μL。反應條件：42 ℃反轉錄50 min，95 ℃ 5 min滅活反轉錄酶。最后，使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（日本Takara公司）在Life Technologies Prism 7500實時PCR系統（美國Applied Biosystems公司）進行實時PCR分析。AFAP1-AS1上游引物為5′-GCGGTAGCTTATCAGACTG-3′，下游引物為5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT -3′，擴增片段長度為340 bp；GAPDH上游引物為5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物為5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′，擴增片段長度為496 bp。構建25 μL的實時PCR反應體系：SYBR? Premix Ex Taq Ⅱ（2×） 12.5 μL，PCR上游引物（10 μmol/L） 1 μL，PCR下游引物（10 μmol/L） 1 μL，cDNA 2 μL，無核酸酶水8.5 μL。PCR反應熱循環條件如下：95 ℃10 min，95 ℃ 10 s，40個循環；58 ℃ 20 s，72 ℃30 s，4 ℃ 5 min。收集熒光信號，2–ΔΔCT相對定量方法分析檢測AFAP1-AS1 mRNA的相對表達水平。
1.4 組織病理學診斷
術中切取甲狀腺結節組織，10%多聚甲醛溶液固定24 h，經梯度脫水、常規石蠟包埋、厚5 μm切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后制作成病理切片。組織學診斷由兩名病理醫師獨立作出診斷。
1.5 統計學方法
使用SPSS 27.0統計軟件對數據進行分析。符合正態分布的定量資料以均數±標準差（
±s）表示且2組間比較采用獨立樣本比較的t檢驗。定性資料以頻數和百分比（%）表示且采用卡方（χ2）檢驗。等級資料比較采用秩和檢驗。采用Pearson相關性分析方法分析FNA洗脫液中AFAP1-AS1 mRNA表達與USE 評分之間的相關性。以術后病理結果為金標準，采用受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線確定USE評分聯合FNA洗脫液中AFAP1-AS1 mRNA表達檢測甲狀腺結節惡性的敏感度和特異度。采用面積計算法計算ROC曲線下面積（area under ROC curve，AUC）對甲狀腺結節良惡性的區分能力。均為雙側檢驗，檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 術后病理結果
本研究共收集到符合條件的124例甲狀腺結節患者，男42例，女82例；年齡28～62歲、（35.7±4.9）歲。術前檢查甲狀腺結節最大直徑0.5～4.8 cm、（0.94±0.35） cm。124例患者共檢測了174枚甲狀腺結節，有62枚（45例）甲狀腺結節術后組織病理學診斷為惡性，其中甲狀腺乳頭狀癌54枚（39例），甲狀腺濾泡狀癌6枚（4例），甲狀腺髓樣癌2枚（2例）；112枚（79例）甲狀腺結節術后組織病理學診斷為良性，其中結節性甲狀腺腫84枚（60例），甲狀腺腺瘤22枚（14例），甲狀腺肉芽腫性變6枚（5例）。
2.2 甲狀腺結節USE評分情況
良性和惡性甲狀腺結節的USE評分分級構成比總體比較差異有統計學意義（Z=8.82，P<0.001），見表1；USE 評分在良性甲狀腺結節中為（2.28±1.16）分，在惡性結節中為（4.26±1.01）分 ［均數差（mean difference，MD）及其95%可信區間（95% confidence interval，95%CI）=2.98（2.76，3.20），t=30.85，P<0.001］。
表1
良惡性甲狀腺結節的USE評分分級比較結果［甲狀腺結節數目（%） ］
2.3 甲狀腺結節FNA洗脫液中AFAP1-AS1 mRNA表達情況
惡性甲狀腺結節的FNA中洗脫液AFAP1-AS1 mRNA表達明顯高于良性甲狀腺結節 ［1.45±0.27比1.13±0.16，MD（95%CI）=1.45（1.39，1.50），t=10.69，P<0.001］。
2.4 甲狀腺結節USE評分和FNA洗脫液中AFAP1-AS1 mRNA表達相關性分析結果
Pearson相關性分析結果（圖1a）顯示，甲狀腺結節USE評分和FNA洗脫液中AFAP1-AS1 mRNA表達之間呈正相關（r=0.58，P<0.001）。
圖1
示甲狀腺結節USE評分和FNA洗脫液中AFAP1-AS1 mRNA表達相關性分析（a）及USE評分聯合FNA洗脫液中AFAP1-AS1 mRNA表達診斷甲狀腺惡性結節的ROC曲線（b）
2.5 USE 評分聯合FNA洗脫液中AFAP1-AS1 mRNA對甲狀腺惡性結節的診斷效能
ROC曲線評估USE評分、FNA洗脫液中AFAP1-AS1 mRNA以及此二者聯合對甲狀腺惡性結節的診斷效能結果見圖1b和表2。結果顯示，USE評分聯合FNA洗脫液中AFAP1-AS1 mRNA檢測對甲狀腺結節的診斷效能優于USE評分（Z=2.37，P<0.05）和FNA洗脫液中AFAP1-AS1 mRNA表達（Z=3.65，P<0.05）單個指標對甲狀腺結節良惡性的診斷價值。
表2
USE評分聯合FNA洗脫液中AFAP1-AS1 mRNA表達對甲狀腺惡性結節的診斷效能
3 討論
當甲狀腺惡性結節的浸潤范圍較小或基底膜尚未突破周圍浸潤、結節周圍組織尚未發生繼發性改變時，常規二維超聲下結節往往表現出規則的形態和清晰的邊界，其良惡性特征不易區分。而USE主要通過將組織彈性硬度作為當前超聲檢查技術的另一個可測量特性進行綜合分析，與常規二維超聲成像的機制不同，它可以更好地識別甲狀腺結節的良性和惡性并做出更準確的鑒別診斷[12]。在本研究中共納入了174枚甲狀腺結節，術后病理學確診62枚結節為惡性，術前USE檢查結果發現，良性結節中1～3分90枚、4～5分22枚，惡性結節中1～3分14枚、4～5分48枚，USE在診斷甲狀腺結節良惡性的敏感性為67.7%、特異性為84.9%。由于甲狀腺結節周圍組織的彈性系數重疊，以及結節伴有炎癥、增生等改變，在USE檢測過程中可能會發生誤診。Unlütürk等[13]報道，USE檢測甲狀腺惡性結節的敏感性和預測價值有限，應結合其他檢測指標。另有相關研究[14-15]也報道，USE聯合二維超聲TI-RADS評分以及其他實驗室檢測手段可以提高診斷效能。
雖然FNA是目前術前評估甲狀腺結節良惡性病變的首選方法，但是由于受操作者的技術限制、采樣面積和不完整采樣導致的樣本數量和樣本質量不確定，仍有部分甲狀腺結節無法通過FNA準確診斷。Dong等[16]報道，≤5 mm的小甲狀腺結節可能容易導致FNA假陽性結果，而 >20 mm的大結節會導致FNA假陰性結果。因此，提高FNA檢查的敏感性和特異性的其他方法或技術對于臨床診斷甲狀腺結節而言是迫切需要的。
近年有研究[17-18]表明，FNA洗脫液樣本的分子分析是一種有效的輔助檢查，具有較高的特異性和陽性預測價值，它針對甲狀腺腫瘤基因表達類型和基因突變狀態的檢測分析有助于區分甲狀腺結節的良惡性，并指導初始手術的范圍。姚玉唐等[19]報道，FNA洗脫液中甲狀腺球蛋白檢測不僅能提高診斷甲狀腺癌的敏感性和準確度，還能為甲狀腺癌頸部淋巴結的轉移診斷提供重要信息。本研究中檢測FNA洗脫液中AFAP1-AS1 mRNA的表達來對甲狀腺結節良惡性進行評估。AFAP1-AS1已被證明在多種惡性腫瘤組織細胞中過表達，其過表達往往與腫瘤生長轉移和患者的預后不良密切相關。目前亦有研究[20-21]證實，AFAP1-AS1在甲狀腺癌組織中高度表達，下調甲狀腺癌細胞中AFAP1-AS1的表達能顯著抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移能力。提示AFAP1-AS1作為癌基因，與甲狀腺癌的關系非常密切，具有作為甲狀腺癌診斷分子標志物的潛能。本研究中對174枚甲狀腺結節組織在術前行FNA洗脫液AFAP1-AS1 mRNA表達檢測，結果表明，甲狀腺惡性結節FNA洗脫液AFAP1-AS1 mRNA表達高于甲狀腺良性結節（P<0.01）；Pearson相關性分析結果也表明，甲狀腺結節FNA洗脫液AFAP1-AS1 mRNA表達與USE 評分之間存在明顯的正相關（r=0.58，P<0.05）；以AFAP1-AS1 mRNA表達相對值1.15為截斷值時診斷甲狀腺結節良惡性的敏感度和特異度分別為88.7%和59.8%，能較好地區分甲狀腺結節良惡性，這與既往文獻[22]報道結論基本一致。
雖然單獨USE評分和FNA洗脫液中AFAP1-AS1 mRNA表達在鑒別診斷甲狀腺結節良惡性方面具有一定的臨床應用價值，但是單一檢查技術的漏診率和誤診率仍然較高。因此，在本研究中將USE評分聯合FNA洗脫液中AFAP1-AS1 mRNA表達檢測用于對甲狀腺結節的診斷，結果顯示，它診斷甲狀腺結節良惡性的敏感度 、特異度和AUC均高于這二者單一檢測結果。
總之，從本研究初步研究結果看，USE評分聯合FNA洗脫液中AFAP1-AS1 mRNA表達檢測可以提高甲狀腺結節良惡性診斷的敏感性和特異性，可以較好地進行區分，有助于臨床醫生在術前做出較為準確地診斷。然而本研究仍存在一些局限性：甲狀腺結節的樣本量有限，且樣本量僅來源于單中心，其臨床應用的普遍性有待多中心的數據驗證，仍需要未來開展多中心、大樣本的隨機對照試驗研究來評估USE評分和FNA洗脫液中AFAP1-AS1 mRNA表達聯合應用的價值。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：黃蓉提出研究思路、設計研究方案、論文起草及最終版本修訂；葉藍藍和鄧晶負責進行實驗檢測；周傳東負責采集、清洗和分析數據。
倫理聲明：本研究通過了深圳市福田區第二人民醫院倫理委員會的審批（批文編號：醫倫審CS8140472）。
甲狀腺結節患病率高達70%左右，盡管大部分甲狀腺結節是良性，但是仍有10%～15%為惡性[1]。目前甲狀腺結節主要通過甲狀腺影像報告與數據系統（thyroid imaging reporting and data system，TI-RADS）進行風險預測。然而在基于常規二維超聲檢查的TI-RADS中，非典型良性和惡性甲狀腺結節的特征可能重疊，尤其是TI-RADS 3類和4類結節，其特異性和準確性不高。細針抽吸（fine-needle aspiration，FNA）活檢被認為是目前判斷甲狀腺病變良惡性的最有效方法。然而由于FNA組織量較少，仍存在一定的誤診率[2]。因此，仍需探索方便、準確及有效的評估方法。超聲彈性成像（ultrasound elastography，USE ）可用于鑒別甲狀腺結節良惡性，其原理是基于組織硬度由其基質結構性質決定，病理變化如腫瘤或炎癥會改變組織成分和結構，增加病變硬度。相關指南[3]已推薦將USE作為甲狀腺結節的一線評估手段。肌動蛋白絲相關蛋白1反義RNA1（actin filament associated protein 1 anti-sense RNA1，AFAP1-AS1）是一種致癌的長鏈非編碼RNA，在多種惡性腫瘤中異常上調，其上調與惡性腫瘤的某些臨床病理特征關系密切[4-5]，它在甲狀腺癌組織中也較在正常組織中表達明顯升高[6-7]。目前臨床上有通過對病灶進行FNA洗脫液中甲狀腺球蛋白檢測能夠有效提高診斷準確率的研究報道[8-10]。然而目前尚缺乏USE 聯合FNA洗脫液中AFAP1-AS1來鑒別良惡性甲狀腺結節的報道。本研究以甲狀腺結節術后病理結果作為評估甲狀腺結節良惡性的金標準，分析USE 聯合FNA洗脫液中AFAP1-AS1診斷甲狀腺惡性結節中的準確性、敏感度和特異度。
1 資料與方法
1.1 研究對象的納入和排除標準
回顧性收集2020年1月至2022年6月期間在深圳市福田區第二人民醫院（簡稱“我院” ）接受診治且符合本研究納入標準的甲狀腺結節患者作為研究對象。患者納入標準：① 均接受甲狀腺切除術，且在術前同時接受了USE檢查和FNA活檢洗脫液中AFAP1-AS1 mRNA檢查；② 所有入選患者年齡均 ≥18歲；③ 術前甲狀腺結節未接受過任何治療。排除標準：① 排除伴血液系統疾病和嚴重心腦血管疾病患者；② 有其他腫瘤病史。該項研究遵循了世界醫學會赫爾辛基宣言，獲得了我院倫理委員會的批準。所有納入患者每次診斷檢查和治療程序以及本研究發表時均知情同意并自愿簽署知情同意書。
1.2 USE檢查
1.2.1 儀器設備
采用AplioTM 500彩色多普勒超聲診斷系統（日本東芝公司）對甲狀腺結節進行檢查。規格：線陣探頭，探頭頻率4.8～11.0 MHz，具備USE檢查和和軟件分析功能。
1.2.2 檢查方法
由具有5年以上USE檢查和診斷經驗的同一超聲醫生進行。被檢查對象平躺仰臥于檢查床上，充分暴露頸部檢測區域。在USE檢查之前進行二維超聲（尺寸和實質回聲）評估。在機器的彈性成像系統激活后，通過徒手技術對目標區域上方的皮膚進行重復光壓縮來獲得圖像施加壓力時探針垂直于皮膚，避免橫向移動。通過影像存儲記憶對采集的圖像進行評估，進而對壓縮和減壓過程中目標病變處發生的彈性變化進行回顧性評估。根據影像資料確定靶病灶的理想壓力。彈性圖顯示靶病灶區域顏色范圍從紅色（對于彈性應變最大的靶病灶組織部位即表示硬度最軟）到藍色（對于無應變的靶病灶組織部位即表示硬度最硬）。經過7～8次壓縮—松弛循環后，完成彈性成像檢查。
1.2.3 甲狀腺結節硬度USE評分
采用5分法Rago標準[11]：整個結節區域彈性良好，彈性成像顯示為綠色評為1分；結節大部分區域有彈性，彈性成像顯示為藍綠相間分布，以綠色為主評為2分；僅在結節的外圍部分區域有彈性，彈性成像顯示為結節中心區域藍色，周邊為綠色，兩種顏色所占區域比例相近評為3分；結節內無彈性，彈性成像顯示結節整體呈藍色，伴有少許綠色評為4分；結節及周邊組織區域均無彈性，彈性成像顯示這些區域均呈藍色評為5分。診斷標準：1～3分者診斷為良性，4～5分者則診斷為惡性。
1.3 FNA洗脫液中AFAP1-AS1 mRNA檢測
1.3.1 FNA洗脫液制備
手術前患者仰臥位，通過超聲掃描并定位目標結節，選擇FNA路徑。穿刺針為日本八光HAKKO公司生產的23G或25G穿刺針。穿刺部位皮膚進行消毒和局部浸潤麻醉。經超聲引導，針尖在沒有負壓的情況下進入結節內并經過3～4次抽吸，生理鹽水反復沖洗穿刺針，制成洗脫液儲存在–80 ℃條件下待下一步研究。
1.3.2 AFAP1-AS1 mRNA檢測
使用TRIzol試劑盒（美國Invitrogen公司）進行FNA洗脫液樣品的RNA提取。使用NanoDrop微量分光光度計（美國Invitrogen公司）測定RNA的數量和質量，并將RNA儲存在–80 ℃條件下。使用逆轉錄試劑盒（美國Invitrogen公司）將RNA反轉錄成cDNA。構建50 μL反應體系：總RNA 40 μg，10×DNase Ⅰ buffer 5 μL，RNase Inhibitor 20 U，DNaseⅠ（RNase-free） 2 μL（10 U），加入RNase-free dH2O至總體積50 μL。反應條件：42 ℃反轉錄50 min，95 ℃ 5 min滅活反轉錄酶。最后，使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（日本Takara公司）在Life Technologies Prism 7500實時PCR系統（美國Applied Biosystems公司）進行實時PCR分析。AFAP1-AS1上游引物為5′-GCGGTAGCTTATCAGACTG-3′，下游引物為5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT -3′，擴增片段長度為340 bp；GAPDH上游引物為5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物為5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′，擴增片段長度為496 bp。構建25 μL的實時PCR反應體系：SYBR? Premix Ex Taq Ⅱ（2×） 12.5 μL，PCR上游引物（10 μmol/L） 1 μL，PCR下游引物（10 μmol/L） 1 μL，cDNA 2 μL，無核酸酶水8.5 μL。PCR反應熱循環條件如下：95 ℃10 min，95 ℃ 10 s，40個循環；58 ℃ 20 s，72 ℃30 s，4 ℃ 5 min。收集熒光信號，2–ΔΔCT相對定量方法分析檢測AFAP1-AS1 mRNA的相對表達水平。
1.4 組織病理學診斷
術中切取甲狀腺結節組織，10%多聚甲醛溶液固定24 h，經梯度脫水、常規石蠟包埋、厚5 μm切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后制作成病理切片。組織學診斷由兩名病理醫師獨立作出診斷。
1.5 統計學方法
使用SPSS 27.0統計軟件對數據進行分析。符合正態分布的定量資料以均數±標準差（±s）表示且2組間比較采用獨立樣本比較的t檢驗。定性資料以頻數和百分比（%）表示且采用卡方（χ2）檢驗。等級資料比較采用秩和檢驗。采用Pearson相關性分析方法分析FNA洗脫液中AFAP1-AS1 mRNA表達與USE 評分之間的相關性。以術后病理結果為金標準，采用受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線確定USE評分聯合FNA洗脫液中AFAP1-AS1 mRNA表達檢測甲狀腺結節惡性的敏感度和特異度。采用面積計算法計算ROC曲線下面積（area under ROC curve，AUC）對甲狀腺結節良惡性的區分能力。均為雙側檢驗，檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 術后病理結果
本研究共收集到符合條件的124例甲狀腺結節患者，男42例，女82例；年齡28～62歲、（35.7±4.9）歲。術前檢查甲狀腺結節最大直徑0.5～4.8 cm、（0.94±0.35） cm。124例患者共檢測了174枚甲狀腺結節，有62枚（45例）甲狀腺結節術后組織病理學診斷為惡性，其中甲狀腺乳頭狀癌54枚（39例），甲狀腺濾泡狀癌6枚（4例），甲狀腺髓樣癌2枚（2例）；112枚（79例）甲狀腺結節術后組織病理學診斷為良性，其中結節性甲狀腺腫84枚（60例），甲狀腺腺瘤22枚（14例），甲狀腺肉芽腫性變6枚（5例）。
2.2 甲狀腺結節USE評分情況
良性和惡性甲狀腺結節的USE評分分級構成比總體比較差異有統計學意義（Z=8.82，P<0.001），見表1；USE 評分在良性甲狀腺結節中為（2.28±1.16）分，在惡性結節中為（4.26±1.01）分 ［均數差（mean difference，MD）及其95%可信區間（95% confidence interval，95%CI）=2.98（2.76，3.20），t=30.85，P<0.001］。
表1
良惡性甲狀腺結節的USE評分分級比較結果［甲狀腺結節數目（%） ］
2.3 甲狀腺結節FNA洗脫液中AFAP1-AS1 mRNA表達情況
惡性甲狀腺結節的FNA中洗脫液AFAP1-AS1 mRNA表達明顯高于良性甲狀腺結節 ［1.45±0.27比1.13±0.16，MD（95%CI）=1.45（1.39，1.50），t=10.69，P<0.001］。
2.4 甲狀腺結節USE評分和FNA洗脫液中AFAP1-AS1 mRNA表達相關性分析結果
Pearson相關性分析結果（圖1a）顯示，甲狀腺結節USE評分和FNA洗脫液中AFAP1-AS1 mRNA表達之間呈正相關（r=0.58，P<0.001）。
圖1
示甲狀腺結節USE評分和FNA洗脫液中AFAP1-AS1 mRNA表達相關性分析（a）及USE評分聯合FNA洗脫液中AFAP1-AS1 mRNA表達診斷甲狀腺惡性結節的ROC曲線（b）
2.5 USE 評分聯合FNA洗脫液中AFAP1-AS1 mRNA對甲狀腺惡性結節的診斷效能
ROC曲線評估USE評分、FNA洗脫液中AFAP1-AS1 mRNA以及此二者聯合對甲狀腺惡性結節的診斷效能結果見圖1b和表2。結果顯示，USE評分聯合FNA洗脫液中AFAP1-AS1 mRNA檢測對甲狀腺結節的診斷效能優于USE評分（Z=2.37，P<0.05）和FNA洗脫液中AFAP1-AS1 mRNA表達（Z=3.65，P<0.05）單個指標對甲狀腺結節良惡性的診斷價值。
表2
USE評分聯合FNA洗脫液中AFAP1-AS1 mRNA表達對甲狀腺惡性結節的診斷效能
3 討論
當甲狀腺惡性結節的浸潤范圍較小或基底膜尚未突破周圍浸潤、結節周圍組織尚未發生繼發性改變時，常規二維超聲下結節往往表現出規則的形態和清晰的邊界，其良惡性特征不易區分。而USE主要通過將組織彈性硬度作為當前超聲檢查技術的另一個可測量特性進行綜合分析，與常規二維超聲成像的機制不同，它可以更好地識別甲狀腺結節的良性和惡性并做出更準確的鑒別診斷[12]。在本研究中共納入了174枚甲狀腺結節，術后病理學確診62枚結節為惡性，術前USE檢查結果發現，良性結節中1～3分90枚、4～5分22枚，惡性結節中1～3分14枚、4～5分48枚，USE在診斷甲狀腺結節良惡性的敏感性為67.7%、特異性為84.9%。由于甲狀腺結節周圍組織的彈性系數重疊，以及結節伴有炎癥、增生等改變，在USE檢測過程中可能會發生誤診。Unlütürk等[13]報道，USE檢測甲狀腺惡性結節的敏感性和預測價值有限，應結合其他檢測指標。另有相關研究[14-15]也報道，USE聯合二維超聲TI-RADS評分以及其他實驗室檢測手段可以提高診斷效能。
雖然FNA是目前術前評估甲狀腺結節良惡性病變的首選方法，但是由于受操作者的技術限制、采樣面積和不完整采樣導致的樣本數量和樣本質量不確定，仍有部分甲狀腺結節無法通過FNA準確診斷。Dong等[16]報道，≤5 mm的小甲狀腺結節可能容易導致FNA假陽性結果，而 >20 mm的大結節會導致FNA假陰性結果。因此，提高FNA檢查的敏感性和特異性的其他方法或技術對于臨床診斷甲狀腺結節而言是迫切需要的。
近年有研究[17-18]表明，FNA洗脫液樣本的分子分析是一種有效的輔助檢查，具有較高的特異性和陽性預測價值，它針對甲狀腺腫瘤基因表達類型和基因突變狀態的檢測分析有助于區分甲狀腺結節的良惡性，并指導初始手術的范圍。姚玉唐等[19]報道，FNA洗脫液中甲狀腺球蛋白檢測不僅能提高診斷甲狀腺癌的敏感性和準確度，還能為甲狀腺癌頸部淋巴結的轉移診斷提供重要信息。本研究中檢測FNA洗脫液中AFAP1-AS1 mRNA的表達來對甲狀腺結節良惡性進行評估。AFAP1-AS1已被證明在多種惡性腫瘤組織細胞中過表達，其過表達往往與腫瘤生長轉移和患者的預后不良密切相關。目前亦有研究[20-21]證實，AFAP1-AS1在甲狀腺癌組織中高度表達，下調甲狀腺癌細胞中AFAP1-AS1的表達能顯著抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移能力。提示AFAP1-AS1作為癌基因，與甲狀腺癌的關系非常密切，具有作為甲狀腺癌診斷分子標志物的潛能。本研究中對174枚甲狀腺結節組織在術前行FNA洗脫液AFAP1-AS1 mRNA表達檢測，結果表明，甲狀腺惡性結節FNA洗脫液AFAP1-AS1 mRNA表達高于甲狀腺良性結節（P<0.01）；Pearson相關性分析結果也表明，甲狀腺結節FNA洗脫液AFAP1-AS1 mRNA表達與USE 評分之間存在明顯的正相關（r=0.58，P<0.05）；以AFAP1-AS1 mRNA表達相對值1.15為截斷值時診斷甲狀腺結節良惡性的敏感度和特異度分別為88.7%和59.8%，能較好地區分甲狀腺結節良惡性，這與既往文獻[22]報道結論基本一致。
雖然單獨USE評分和FNA洗脫液中AFAP1-AS1 mRNA表達在鑒別診斷甲狀腺結節良惡性方面具有一定的臨床應用價值，但是單一檢查技術的漏診率和誤診率仍然較高。因此，在本研究中將USE評分聯合FNA洗脫液中AFAP1-AS1 mRNA表達檢測用于對甲狀腺結節的診斷，結果顯示，它診斷甲狀腺結節良惡性的敏感度 、特異度和AUC均高于這二者單一檢測結果。
總之，從本研究初步研究結果看，USE評分聯合FNA洗脫液中AFAP1-AS1 mRNA表達檢測可以提高甲狀腺結節良惡性診斷的敏感性和特異性，可以較好地進行區分，有助于臨床醫生在術前做出較為準確地診斷。然而本研究仍存在一些局限性：甲狀腺結節的樣本量有限，且樣本量僅來源于單中心，其臨床應用的普遍性有待多中心的數據驗證，仍需要未來開展多中心、大樣本的隨機對照試驗研究來評估USE評分和FNA洗脫液中AFAP1-AS1 mRNA表達聯合應用的價值。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：黃蓉提出研究思路、設計研究方案、論文起草及最終版本修訂；葉藍藍和鄧晶負責進行實驗檢測；周傳東負責采集、清洗和分析數據。
倫理聲明：本研究通過了深圳市福田區第二人民醫院倫理委員會的審批（批文編號：醫倫審CS8140472）。
