阿爾茨海默癥（AD）是一種以認知障礙為特征的神經退行性疾病，其主要臨床表現是空間工作記憶（SWM）障礙，嚴重影響患者身心健康，而現有藥物療法存在治愈率低等問題，因此非藥物物理療法逐漸受到人們廣泛關注。近年來，一種通過40 Hz光閃爍刺激（40 Hz-LFS）改善AD模型動物SWM功能的新方案取得初步進展，然而具體神經機制尚不清楚。因此，本研究將基于交叉頻率耦合（CFC）探究40 Hz-LFS調控SWM功能的潛在神經機制。本文以10只成年維斯塔爾（Wistar）大鼠為研究對象，首先應用20、40、60 Hz的頻率進行光閃爍刺激（LFS）實時作用，分析不同頻率LFS對海馬體（HPC）和內側前額葉皮層（mPFC）神經振蕩的夾帶效應。結果顯示，40 Hz-LFS能夠形成夾帶效應，調控低頻γ（lγ）節律振蕩的活動強度；隨后將大鼠分為實驗組和對照組，每組5只，進行40 Hz-LFS長期作用（7 d），并通過T迷宮任務檢測其SWM功能，應用相位幅值耦合（PAC）分析HPC與mPFC間（HPC-mPFC）回路的CFC變化。結果表明，實驗組的行為學表現得到提升，θ節律和lγ（θ-lγ）的PAC增強，差異具有統計學意義。本文研究結果提示，長期40 Hz-LFS能夠有效改善大鼠的SWM功能，其原因可能是促進了相關神經回路中振蕩的跨節律信息交流。期望通過本文研究，可為今后進一步研究40 Hz-LFS改善認知功能的機制及促進其臨床應用奠定基礎。
0 引言
阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，AD）是一種進行性老年神經退行疾病[1-2]，其臨床表現為記憶、執行、語言等認知功能障礙，是最常見的早老性癡呆類型。AD患者通常伴隨不同程度的認知功能障礙，日常生活能力逐漸下降，嚴重影響了患者身心健康。目前AD的治療仍是一個難題，現有藥物僅能起到暫時緩解作用，且只對半數患者有效[3]，因此亟需發展新的治療方法。近年來，來自麻省理工學院的研究團隊基于AD動物模型和人類患者γ節律振蕩異常[4-5]，提出一種新穎的非藥物物理治療方案，即利用40 Hz光閃爍刺激（light flicker stimulation，LFS）（40 Hz—LFS）等外部視覺刺激能夠在相應腦區中產生夾帶效應特性，調控認知功能相關腦區γ節律振蕩的強度，從而達到緩解病理特征的效果[6-7]。其中，夾帶效應被定義為“神經振蕩與外部刺激的節律同步”，即腦內神經振蕩與外部刺激的對應節律達到相位同步[8]。通過夾帶效應，LFS不僅有效提升了視覺皮層和多個認知相關腦區的γ振蕩功率，緩解了AD模型動物的β淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）斑塊沉積等病理特征[9-10]，還改善了AD模型動物的認知功能[11-12]。然而，40 Hz—LFS方案調控認知功能的神經電生理機制尚不明確。
研究表明，認知行為的神經機制可能是相關腦區之間的神經信息協同作用，例如海馬體（hippocampus，HPC）[13]和內側前額葉皮層（medial prefrontal cortex，mPFC）[14]都是學習和記憶所必需的大腦結構，兩個腦區之間的信息協同作用對于成功執行認知任務至關重要，尤其是空間工作記憶（spatial working memory，SWM）[15]。SWM是實時記住空間位置的能力，是認知行為中的一項重要功能，SWM障礙是AD的主要臨床特征之一[16]。研究表明，在執行SWM任務時，HPC—mPFC回路中的神經振蕩能夠通過交叉頻率耦合（cross-frequency coupling，CFC）跨腦區協同作用[15]。其中，低頻振蕩相位與高頻振蕩幅值主要通過相位幅值耦合（phase amplitude coupling，PAC）在SWM形成和維持期間發揮關鍵性作用[17]。例如，HPC腦區θ節律（4～12 Hz）與mPFC腦區γ節律（30～100 Hz）振蕩之間的PAC強度在小鼠成功執行SWM任務時升高[18]，而認知障礙模型動物則表現出PAC受損，表明θ—γ節律的PAC與SWM任務編碼過程密切相關[19-20]，可能是關鍵神經機制。因此，基于HPC—mPFC回路PAC角度探究40 Hz—LFS調控認知功能的神經電生理機制，對促進該方案治療AD等認知障礙疾病的臨床應用具有重要意義。
本研究旨在探究40 Hz-LFS對大鼠SWM功能的影響，以及HPC—mPFC回路θ—γ節律信息協同的神經電生理機制。本文首先分析了20、40、60 Hz的LFS實時作用對大鼠HPC和mPFC腦區的夾帶效應，以探究對γ節律振蕩的調控作用；隨后進行40 Hz—LFS長期作用，并通過T迷宮任務評估大鼠的SWM表現；同時計算HPC-mPFC回路θ—γ節律的PAC，從不同節律振蕩遠程協同作用的角度探究40 Hz—LFS長期作用影響SWM功能的神經機制，為促進40 Hz—LFS治療AD等認知障礙疾病的臨床應用提供理論支持。
1 材料和方法
本研究所有實驗程序均按照《實驗動物護理和使用指南》[21]進行，所有實驗步驟環節均已通過了河北工業大學生物醫學倫理委員審查（審查編號：HEBUTaCUC2022052）。
1.1 微電極陣列植入手術與神經電信號獲取
本實驗以10只雄性成年維斯塔爾（Wistar）大鼠為研究對象，體重為300～350 g。動物飼養期間給予充足的水和食物；執行行為學任務期間，限制飲食使大鼠體重保持在自由進食狀態下的85%，以保持食欲。
通過外科手術將多通道微電極陣列植入大鼠HPC和mPFC，以獲取其神經信號。本實驗使用異氟烷氣體麻醉大鼠并固定于立體定位儀進行手術過程，依據腦圖譜[22]將兩個8通道的鎳鉻合金微電極陣列（2×4 配置排列，直徑35 μm，電極間距300 μm）植入大鼠腹側HPC（前囟后4.5～6.5 mm，旁開4.5～5.5 mm，深度為距離腦皮層表面6.5～7.5 mm）和mPFC（前囟前2.5～4.5 mm，旁開0.2～1.0 mm，深度為距離腦皮層表面2.5～3.0 mm）。在電極到達目標腦區后，使用螺釘和牙科水泥進行包埋固定。術后單獨飼養，并給予大鼠5～7 d恢復時間。基于植入的多通道微電極陣列，應用在體多通道電生理記錄系統OmniPlex 128（Plexon Inc.，美國）能夠記錄大鼠HPC和mPFC的神經集群活動，通過放大（增益：5 000）和低通濾波（0.3～300.0 Hz）獲取采樣率為1 000 Hz的局部場電位（local field potentials，LFPs），以進行后續分析。
1.2 LFS方案
首先應用不同頻率（20、40、60 Hz）LFS進行實時作用實驗，分析夾帶效應隨刺激頻率的變化情況，實驗步驟如下：
（1）靜息態5 min；
（2）20 Hz：光刺激5 min+偽刺激5 min，50%占空比為25 ms亮和25 ms暗；
（3）40 Hz：光刺激5 min+偽刺激5 min，50%占空比為12.5 ms亮和12.5 ms暗；
（4）60 Hz：光刺激5 min+偽刺激5 min，50%占空比為8.33 ms亮和8.33 ms暗；
每個刺激步驟間隔為1 h。其中，靜息態是不接受刺激且處于靜息的無任務狀態；光刺激是使用亮度范圍在300～1 200 lux，具有50%占空比的周期性方波，以顏色為自然光的發光二極管（light emitting diode，LED）進行特定頻率的LFS[5]；偽刺激是使用一個不透光的黑色擋板將光源遮住，使大鼠處于在LED閃爍時接收不到光刺激的狀態。
隨后將10只大鼠隨機分為2組：對照組和實驗組，每組5只。對實驗組大鼠進行連續7 d（1 h/d）的LFS長期作用，具體操作步驟為：將大鼠從飼養室運出后，首先置于昏暗的環境中習慣1 h，然后再引入刺激籠（三面黑色、一面透明，且透明一側固定有LED陣列）開始LFS，時長為1 h，如圖1所示；期間允許大鼠在籠內自由活動，但沒有食物和水；刺激完成后，將大鼠放回籠中休息1 h，然后再運回飼養室。對照組，在1 h的LFS期間僅接受正常室內光線照射，其它條件與實驗組相同。
圖1
大鼠LFS示意圖
Figure1.
Diagram of rats under LFS
1.3 SWM行為學任務
基于食物獎勵的T迷宮延遲選擇交替任務，是一種測試SWM的行為學實驗范式[23]，廣泛應用于腦認知活動評估。本研究使用的“T迷宮”由一個起始臂（臂端為起始區域）和兩個具有食物獎勵的目標臂（臂端有固定食槽，可放置食物作為獎勵）組成，如圖2所示。
圖2
T迷宮延遲交替任務示意圖
Figure2.
Diagram of the delayed-alternation task on T-maze
T迷宮任務，包括訓練階段和測試階段。訓練階段，大鼠接受訓練（20次/d）至正確率達到“學會”標準。過程簡述如下：每次任務包括自由選擇和延遲交替選擇兩個過程。在自由選擇過程中，大鼠從起始區域出發至行為選擇參考點（reference point，RP）進行選擇，然后向左或向右移動進入任意一個目標臂以獲得食物獎勵。隨后大鼠返回起始區域，并在等待5 s后，開始延遲交替選擇過程，即大鼠必須選擇與自由選擇過程中相反的目標臂，才能獲得食物獎勵，并記錄為行為學正確；反之，則記錄為錯誤。之后，大鼠自主回到起始區域，本次任務結束。當大鼠行為學正確率連續2 d超過80%時，被認為達到“學會”的標準，完成訓練階段。隨后進行測試階段，過程與訓練階段相同，執行5 d（20次/d）。
1.4 數據處理與分析
應用在體多通道電生理記錄系統OmniPlex 128（Plexon Inc.，美國）記錄不同頻率LFS實時作用時的LFPs，以及T—迷宮任務測試階段的LFPs，并隨機選取每只大鼠20次行為學正確的數據進行分析。對于LFPs數據，首先通過小波（coif5）變換去除基線漂移，并通過陷波濾波器消除50 Hz工頻干擾。使用數學分析軟件Matlab 9.1（MathWorks Inc.，美國）函數庫中的韋爾奇功率譜方法（Pwelch）計算信號的功率譜密度（power spectral density，PSD），以分析其活動強度，使用500 ms時間窗口和50%重疊。
采用PAC方法測量慢節律（θ）相位和快節律（γ）幅值之間的耦合模式，并通過調制指數（modulation index，MI）（以符號MI表示）的方法[24]進行計算，過程簡述如下：首先使用一組窄帶濾波器分別檢測θ振蕩相位的上升和下降斜率，并使用寬帶濾波器找到波谷和波峰，以消除慢節律信號相位因單調變化而形成的偽耦合現象，并將相位信號標記為φ(t)。然后，將φ(t)的每個周期分為4個相位段，分別對應波峰至波谷的下降以及上升時期，再將每個相位段平均分成4份，則一個相位周期被分為16個相位段。對于γ振蕩，使用一個帶寬固定、且頻率中心在γ節律范圍逐步平移的濾波器進行濾波，其帶寬至少是相位信號頻率的兩倍。由于HPC中的主要θ節律振蕩約為8 Hz，帶寬應至少為16 Hz，本研究選取的帶寬為20 Hz，符合兩倍的要求。然后利用希爾伯特變換計算γ振蕩的幅值包絡，記為A(t)。
接下來，計算每個相位段對應γ振蕩包絡Ay的平均值。將各相位段所求的Ay除以各相位段均值的總和，從而將幅值信息轉化為分布概率的信息，如式(1)所示：
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式中，Ay(j)表示相位段j處的γ幅值包絡Ay的平均值，Pj為Ay(j)的分布概率，N為相位段的個數。當各個相位段所對應的幅值均值相同時，此分布為均勻分布。應用標準化熵度量H來表征調制結果，定義如式(2)所示：
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當Pj = 1/N時，H達到最大值，記為Hmax。通過標準化，可以得到基于熵的MI。本研究使用MI來表示信號間的PAC強度，如式(3)所示：
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當MI接近0時，表示相位和幅值的耦合強度較低；MI較大時，表示存在較高強度的耦合。
1.5 統計分析
本研究共記錄了10只大鼠的200次任務，平均每只大鼠20次。應用統計軟件GraphPad Prism 9.0（GraphPad Prism Software Inc., 美國）的單因素方差分析（one-way ANOVA）來分析LFS實時作用結果中的統計學意義；應用t檢驗分析實驗組和對照組之間的差異，以判斷是否具有統計學意義。文中數據均以均值±標準誤表示，檢驗水準為0.05。
2 結果
2.1 不同頻率LFS實時作用的夾帶效應
為探究不同頻率LFS對大鼠高階認知腦區的夾帶效應，本研究分析了大鼠HPC和mPFC腦區的LFPs在受到20、40、60 Hz頻率LFS實時作用時的功率變化，并使用PSD表示。如圖3所示，為大鼠HPC和mPFC腦區LFPs對應刺激頻率處的PSD變化，圖3中黑色曲線表示靜息態，紅色表示各頻率LFS作用，藍色表示偽刺激，陰影為標準差。相比靜息態和偽刺激，LFPs分別在20 Hz—LFS和40 Hz—LFS作用時，對應頻率LFPs的PSD出現尖峰；而60 Hz—LFS作用時，則沒有出現尖峰。提示，20 Hz和40 Hz的刺激頻率可能會在HPC和mPFC腦區形成夾帶效應，而60 Hz的刺激頻率則不會。
圖3
對應刺激頻率LFPs的功率譜密度變化
Figure3.
PSD changes of LFPs at corresponding stimulus frequencies
如圖4所示，為大鼠HPC和mPFC神經振蕩對應頻率處PSD在LFS實時作用下的統計結果。
圖4
靜息態、LFS和偽刺激狀態下對應刺激頻率LFPs的功率譜密度對比（*P < 0.01）
Figure4.
Comparison of PSD of LFPs at corresponding stimulus frequencies in resting, light flicker stimulating and pseudo-stimulating states (*P < 0.01)
（1）20 Hz—LFS實時作用結果顯示，HPC腦區20 Hz節律振蕩的PSD在三種狀態下的差異具有統計學意義［F（2，147）= 65.99，P < 0.01）］，LFS時的PSD高于靜息態（t = 9.72，P < 0.01）和偽刺激（t = 10.16，P < 0.01），差異具有統計學意義，靜息態與偽刺激的差異無統計學意義（t = 0.43，P > 0.99）；mPFC腦區PSD的差異也具有統計學意義［F（2，147） = 75.01，P < 0.01］，LFS時的PSD高于靜息態（t = 10.75，P < 0.01）和偽刺激（t = 10.46，P < 0.01），差異具有統計學意義，靜息態與偽刺激的差異無統計學意義（t = 0.29，P > 0.99）。
（2）40 Hz—LFS實時作用結果顯示，HPC腦區40 Hz節律振蕩的PSD在三種狀態下的差異具有統計學意義［F（2，147） = 62.75，P < 0.01］，LFS時的PSD高于靜息態（t = 10.20，P < 0.01）和偽刺激（t = 9.11，P < 0.01），差異具有統計學意義，靜息態與偽刺激的差異無統計學意義（t = 1.09，P = 0.826）；mPFC腦區PSD的差異也具有統計學意義［F（2，147） = 70.88，P < 0.01］，LFS時的PSD高于靜息態（t = 10.88，P < 0.01）和偽刺激（t = 9.63，P < 0.01），差異具有統計學意義，而靜息態與偽刺激的差異無統計學意義（t = 1.24，P = 0.647）。
（3）60 Hz—LFS實時作用結果顯示，HPC腦區40Hz節律振蕩的PSD在三種狀態下的差異無統計學意義［F（2，147） = 0.45，P = 0.826］，同時mPFC腦區的差異也不具有統計學意義［F（2，147） = 0.25，P = 0.779］。
結果提示，20 Hz—LFS和40 Hz—LFS均能夠明顯增強對應頻率處的PSD，即能夠在大鼠的HPC和mPFC腦區形成夾帶效應。
基于θ、γ節律與SWM的密切關系[18-19]，進一步分析不同頻率的LFS實時作用對θ、γ節律PSD的影響，包括θ（4～12 Hz）、低頻γ（low-frequency γ，lγ）（30～60 Hz）和高頻γ（high-frequency γ，hγ）（60～100 Hz）節律，結果如圖5所示。
圖5
靜息態和不同頻率LFS作用時各節律振蕩功率譜密度的對比（*P < 0.01）
Figure5.
Comparison of PSD of oscillations in various rhythms at resting state and LFS with different frequencies (*P < 0.01)
HPC腦區lγ節律PSD的組間差異具有統計學意義［F（3，196） = 142.70，P < 0.01］，40 Hz—LFS作用時高于靜息態（t = 17.03，P < 0.01）、20 Hz—LFS（t = 15.98，P < 0.01）和60 Hz—LFS（t = 17.53，P < 0.01），差異具有統計學意義；θ和hγ的PSD統計結果顯示組間差異不具有統計學意義［θ：F（3，196） = 1.98，P = 0.118；hγ：F（3，196） = 2.03，P = 0.111］。mPFC的結果與HPC類似，lγ節律PSD的組間差異具有統計學意義［F（3，196） = 34.75，P < 0.01］，40 Hz—LFS作用時高于靜息態（t = 9.13，P < 0.01）、20 Hz—LFS（t = 6.96，P < 0.01）和60 Hz—LFS（t = 8.33，P < 0.01），差異具有統計學意義；θ和hγ的PSD統計結果則顯示組間差異不具有統計學意義［θ：F（3，196） = 0.51，P = 0.673；hγ：F（3，196） = 1.01，P = 0.387］。結果提示，40 Hz—LFS能夠顯著增強HPC和mPFC腦區lγ節律神經振蕩的活動功率。
2.2 40 Hz—LFS長期作用對大鼠T迷宮行為表現的影響
為探究長期40 Hz—LFS對SWM功能的影響，本研究通過T迷宮延遲交替選擇任務檢測了大鼠在40 Hz—LFS作用7 d后的SWM行為表現。首先，統計訓練過程中大鼠每天的正確率，以及滿足行為學標準（如“1.3小節”中所述，至少連續兩天正確率超過80％）所需要的天數。結果如圖6所示，隨著訓練天數的增加，正確率呈逐漸上升趨勢，且各組大鼠在經過訓練之后均滿足行為學標準，數據以均值±標準差表示。實驗組滿足行為學標準的平均時長［t=(4.00 ± 0.32) d］少于對照組［t=(6.28 ± 0.51) d］，差異具有統計學意義（t = 4.00，P < 0.01）。結果表明，實驗組大鼠需要較少的時間和訓練就能夠學會相同的任務，反映出其SWM功能得到改善。
圖6
大鼠T迷宮延遲交替選擇任務行為表現
Figure6.
Behavior performance of rats in T-maze delayed alternative choice task
2.3 40 Hz—LFS長期作用對大鼠HPC—mPFC回路PSD的影響
為探究40 Hz—LFS長期作用改善大鼠SWM行為表現的神經機制，本研究分析了實驗組和對照組大鼠HPC和mPFC腦區神經振蕩在靜息狀態下的活動變化，結果如圖7所示。所有節律的PSD在兩組數據中的差異均無統計學意義（P > 0.05）。該研究結果提示，40 Hz—LFS長期作用并沒有改變大鼠靜息狀態下HPC和mPFC腦區40 Hz神經振蕩的活動強度。
圖7
兩組大鼠各節律振蕩的功率譜密度對比
Figure7.
Comparison of PSD of oscillations in various rhythms between two groups of rats
2.4 40 Hz—LFS長期作用對大鼠HPC—mPFC回路PAC機制的影響
選取大鼠T迷宮任務延遲交替過程中關鍵時期[25-26]的LFP數據（RP前1 s的決策時期）進行分析，以探索兩組大鼠的PAC模式變化。如圖8所示，為大鼠HPC—mPFC回路的PAC模式示意圖，橫軸代表θ相位的頻率，縱軸為γ幅值的頻率，PAC強度用MI表示，顏色越接近紅色表示MI越高。由圖8可見，在γ節律之間發現不同的耦合峰值，表明γ節律范圍內可能存在不同的耦合模式。為此，將γ節律范圍分為lγ（30～60 Hz）和hγ（60～100 Hz），分別統計其與θ相位之間的耦合強度。
圖8
大鼠HPC—mPFC回路的PAC模式示意圖
Figure8.
PAC pattern of the HPC-mPFC circuit in rats
如圖9所示，為兩組大鼠的MI對比結果。其中，實驗組HPC（θ）—mPFC（lγ）的MI高于對照組，差異具有統計學意義（t = 2.54，P = 0.016）。同時，mPFC（θ）—HPC（lγ）的MI結果也顯示實驗組高于對照組，差異具有統計學意義（t = 2.63，P = 0.012）。而兩組MI在HPC（θ）— mPFC（hγ）（t = 0.17，P = 0. 868）和mPFC（θ）—HPC（hγ）（t = 1.29，P = 0.204）的差異無統計學意義。研究結果提示，40 Hz—LFS長期作用能夠增強大鼠HPC—mPFC回路θ—lγ之間的PAC強度。
圖9
兩組大鼠HPC—mPFC的MI對比
Figure9.
MI comparison of HPC-mPFC between two groups
3 討論
本研究通過分析不同頻率LFS實時作用在HPC和mPFC腦區形成的夾帶效應，以及40 Hz—LFS長期作用后，大鼠執行T迷宮任務的行為表現與HPC—mPFC回路θ—γ節律的PAC模式，從不同節律神經振蕩協同作用的角度，探究了40 Hz—LFS影響大鼠SWM功能的神經機制。結果發現，40 Hz—LFS實時作用能夠顯著增強lγ節律的振蕩活動，對HPC和mPFC腦區形成有效的夾帶效應，達到調控神經振蕩目的。Adaikkan等[10]的研究也表明，40 Hz—LFS能夠有效夾帶視覺皮層以及HPC等高階腦區的γ節律，增強γ節律振蕩活動的功率，與本研究的結果一致。此外，本研究還發現60 Hz—LFS沒有表現出明顯的夾帶效應，可能的原因是，視覺誘發的神經振蕩響應在大腦空間傳播時對刺激頻率很敏感，頻率較高時（>54 Hz）更多地集中在視覺皮層[27]，并沒有傳輸到HPC和mPFC等腦區。Lee等[28]還報道了節律性LFS對人體進行刺激時，頻率為34～38 Hz的白光能夠同步人體大腦中更強且范圍更廣的γ振蕩。這些研究表明，節律性LFS在包含40 Hz的低頻γ節律范圍內可能比在高頻γ節律范圍更適合夾帶效應。盡管這種基于LFS的物理刺激模式能夠有效增強神經振蕩活動強度，調控大腦皮層神經活動，但仍需對刺激模式進一步優化，如結合聲音和不同顏色的光（如藍光和紅光等），以達到更好的刺激效果。
本文大鼠行為學結果表明，相比未受刺激的對照組，經過40 Hz—LFS的實驗組大鼠達到T—迷宮任務標準所需的天數較少，即SWM功能得到改善。而之前的研究也報道了，40 Hz—LFS能夠有效改善實驗動物莫里斯水迷宮等SWM任務的表現[9-10]，與本研究結果一致。此外，相關研究還從分子蛋白水平探究了可能的作用機制，結果表明40 Hz—LFS長期作用能夠有效降低AD模型小鼠的Aβ和微管相關蛋白（tubulin-associated unit，tau）水平[4]，減少小膠質介導的炎癥應答[9]，增強相關基因和蛋白質的表達[11]，促進神經元中突觸傳遞和細胞內轉運[12]，從而起到神經保護作用[10]，達到改善AD的效果。這些結果都為促進40 Hz—LFS的發展提供了支持，然而在臨床應用中，這種非藥物性的療法仍然是一個相對較新的研究領域，仍需進一步開發其潛在的治療效果[29-30]，為將來治療AD提供一種可能的選擇。
由于LFPs可以直接反映神經元集群的電生理活動，因此研究LFPs特征對探究神經系統認知功能的作用機制具有重要意義。本研究發現，40 Hz—LFS長期作用沒有對靜息態的神經振蕩活動造成影響，而是提高了大鼠T迷宮任務過程中HPC和mPFC腦區θ—lγ的PAC強度，表明40 Hz—LFS加強了HPC—mPFC回路不同節律神經振蕩的協同作用。有研究表明，不同節律神經振蕩之間的PAC可能是大鼠執行認知任務的關鍵神經機制，尤其是HPC和mPFC腦區的PAC在大鼠的認知任務活動中有效編碼了SWM[13, 18, 25]。Tort等[25]和Wang等[26]的研究表明，PAC峰值出現在T迷宮任務RP附近的決策期間，反映出PAC在不同時間尺度上主動參與認知任務的動態過程，體現了PAC在編碼認知任務中的神經作用機制。此外，本研究還發現θ相位與多個γ子節律幅值發生了耦合，可能是由于不同的γ子節律范圍具有獨立的生理意義，并在WM過程發揮不同的功能。具體而言，40 Hz—LFS長期作用顯著增強了θ—lγ的PAC強度，對θ—hγ無明顯影響，可能的原因是40 Hz—LFS長期刺激對lγ節律振蕩的活動強度有增強效果，進而加強了與θ節律的耦合作用，但并沒有對hγ產生作用。結合大鼠SWM行為學結果，本研究結果提示，θ—lγ的PAC上升引起的HPC—mPFC回路神經信息協同作用增強，可能是40 Hz—LFS改善大鼠SWM任務行為表現的神經機制。然而，本研究也存在樣本量較少、刺激時長不完善等局限性，故尚需進一步完善相關研究內容。
4 結論
本研究基于在體多通道電生理記錄系統OmniPlex 128（Plexon Inc.，美國）實時分析了大鼠HPC和mPFC腦區在不同頻率（20、40、60 Hz）LFS實時作用時的夾帶效應，隨后進行40 Hz—LFS長期作用，并通過T迷宮延遲交替任務評估大鼠的SWM表現，同時計算了HPC—mPFC回路θ—γ節律的PAC強度。結果表明，40 Hz—LFS實時作用表現出明顯的夾帶現象，能夠顯著增強lγ節律振蕩的活動功率；長期作用則顯著改善大鼠SWM任務行為表現，增強其認知水平，提高HPC—mPFC回路θ—lγ的PAC強度，加強不同節律振蕩以CFC方式進行的跨腦區協同作用。
綜上，本研究結果表明40 Hz—LFS長期作用有效增強了大鼠HPC—mPFC回路θ—lγ的PAC強度，促進了不同節律振蕩在腦區間的協同作用，進而改善了大鼠的SWM功能，為今后研究40 Hz—LFS改善認知功能的機制及促進其臨床應用提供了支持。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：作者王龍龍參與了論文的選題、實驗設計、數據采集和分析、論文寫作；作者李雙燕和徐桂芝參與了論文的選題、實驗設計、論文內容審核和論文修改；作者李潤澤參與了數據采集、分析和論文修改。
倫理聲明：本研究所有實驗步驟環節均已通過了河北工業大學生物醫學倫理委員審查（審查編號：HEBUTaCUC2022052）。
0 引言
阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，AD）是一種進行性老年神經退行疾病[1-2]，其臨床表現為記憶、執行、語言等認知功能障礙，是最常見的早老性癡呆類型。AD患者通常伴隨不同程度的認知功能障礙，日常生活能力逐漸下降，嚴重影響了患者身心健康。目前AD的治療仍是一個難題，現有藥物僅能起到暫時緩解作用，且只對半數患者有效[3]，因此亟需發展新的治療方法。近年來，來自麻省理工學院的研究團隊基于AD動物模型和人類患者γ節律振蕩異常[4-5]，提出一種新穎的非藥物物理治療方案，即利用40 Hz光閃爍刺激（light flicker stimulation，LFS）（40 Hz—LFS）等外部視覺刺激能夠在相應腦區中產生夾帶效應特性，調控認知功能相關腦區γ節律振蕩的強度，從而達到緩解病理特征的效果[6-7]。其中，夾帶效應被定義為“神經振蕩與外部刺激的節律同步”，即腦內神經振蕩與外部刺激的對應節律達到相位同步[8]。通過夾帶效應，LFS不僅有效提升了視覺皮層和多個認知相關腦區的γ振蕩功率，緩解了AD模型動物的β淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）斑塊沉積等病理特征[9-10]，還改善了AD模型動物的認知功能[11-12]。然而，40 Hz—LFS方案調控認知功能的神經電生理機制尚不明確。
研究表明，認知行為的神經機制可能是相關腦區之間的神經信息協同作用，例如海馬體（hippocampus，HPC）[13]和內側前額葉皮層（medial prefrontal cortex，mPFC）[14]都是學習和記憶所必需的大腦結構，兩個腦區之間的信息協同作用對于成功執行認知任務至關重要，尤其是空間工作記憶（spatial working memory，SWM）[15]。SWM是實時記住空間位置的能力，是認知行為中的一項重要功能，SWM障礙是AD的主要臨床特征之一[16]。研究表明，在執行SWM任務時，HPC—mPFC回路中的神經振蕩能夠通過交叉頻率耦合（cross-frequency coupling，CFC）跨腦區協同作用[15]。其中，低頻振蕩相位與高頻振蕩幅值主要通過相位幅值耦合（phase amplitude coupling，PAC）在SWM形成和維持期間發揮關鍵性作用[17]。例如，HPC腦區θ節律（4～12 Hz）與mPFC腦區γ節律（30～100 Hz）振蕩之間的PAC強度在小鼠成功執行SWM任務時升高[18]，而認知障礙模型動物則表現出PAC受損，表明θ—γ節律的PAC與SWM任務編碼過程密切相關[19-20]，可能是關鍵神經機制。因此，基于HPC—mPFC回路PAC角度探究40 Hz—LFS調控認知功能的神經電生理機制，對促進該方案治療AD等認知障礙疾病的臨床應用具有重要意義。
本研究旨在探究40 Hz-LFS對大鼠SWM功能的影響，以及HPC—mPFC回路θ—γ節律信息協同的神經電生理機制。本文首先分析了20、40、60 Hz的LFS實時作用對大鼠HPC和mPFC腦區的夾帶效應，以探究對γ節律振蕩的調控作用；隨后進行40 Hz—LFS長期作用，并通過T迷宮任務評估大鼠的SWM表現；同時計算HPC-mPFC回路θ—γ節律的PAC，從不同節律振蕩遠程協同作用的角度探究40 Hz—LFS長期作用影響SWM功能的神經機制，為促進40 Hz—LFS治療AD等認知障礙疾病的臨床應用提供理論支持。
1 材料和方法
本研究所有實驗程序均按照《實驗動物護理和使用指南》[21]進行，所有實驗步驟環節均已通過了河北工業大學生物醫學倫理委員審查（審查編號：HEBUTaCUC2022052）。
1.1 微電極陣列植入手術與神經電信號獲取
本實驗以10只雄性成年維斯塔爾（Wistar）大鼠為研究對象，體重為300～350 g。動物飼養期間給予充足的水和食物；執行行為學任務期間，限制飲食使大鼠體重保持在自由進食狀態下的85%，以保持食欲。
通過外科手術將多通道微電極陣列植入大鼠HPC和mPFC，以獲取其神經信號。本實驗使用異氟烷氣體麻醉大鼠并固定于立體定位儀進行手術過程，依據腦圖譜[22]將兩個8通道的鎳鉻合金微電極陣列（2×4 配置排列，直徑35 μm，電極間距300 μm）植入大鼠腹側HPC（前囟后4.5～6.5 mm，旁開4.5～5.5 mm，深度為距離腦皮層表面6.5～7.5 mm）和mPFC（前囟前2.5～4.5 mm，旁開0.2～1.0 mm，深度為距離腦皮層表面2.5～3.0 mm）。在電極到達目標腦區后，使用螺釘和牙科水泥進行包埋固定。術后單獨飼養，并給予大鼠5～7 d恢復時間。基于植入的多通道微電極陣列，應用在體多通道電生理記錄系統OmniPlex 128（Plexon Inc.，美國）能夠記錄大鼠HPC和mPFC的神經集群活動，通過放大（增益：5 000）和低通濾波（0.3～300.0 Hz）獲取采樣率為1 000 Hz的局部場電位（local field potentials，LFPs），以進行后續分析。
1.2 LFS方案
首先應用不同頻率（20、40、60 Hz）LFS進行實時作用實驗，分析夾帶效應隨刺激頻率的變化情況，實驗步驟如下：
（1）靜息態5 min；
（2）20 Hz：光刺激5 min+偽刺激5 min，50%占空比為25 ms亮和25 ms暗；
（3）40 Hz：光刺激5 min+偽刺激5 min，50%占空比為12.5 ms亮和12.5 ms暗；
（4）60 Hz：光刺激5 min+偽刺激5 min，50%占空比為8.33 ms亮和8.33 ms暗；
每個刺激步驟間隔為1 h。其中，靜息態是不接受刺激且處于靜息的無任務狀態；光刺激是使用亮度范圍在300～1 200 lux，具有50%占空比的周期性方波，以顏色為自然光的發光二極管（light emitting diode，LED）進行特定頻率的LFS[5]；偽刺激是使用一個不透光的黑色擋板將光源遮住，使大鼠處于在LED閃爍時接收不到光刺激的狀態。
隨后將10只大鼠隨機分為2組：對照組和實驗組，每組5只。對實驗組大鼠進行連續7 d（1 h/d）的LFS長期作用，具體操作步驟為：將大鼠從飼養室運出后，首先置于昏暗的環境中習慣1 h，然后再引入刺激籠（三面黑色、一面透明，且透明一側固定有LED陣列）開始LFS，時長為1 h，如圖1所示；期間允許大鼠在籠內自由活動，但沒有食物和水；刺激完成后，將大鼠放回籠中休息1 h，然后再運回飼養室。對照組，在1 h的LFS期間僅接受正常室內光線照射，其它條件與實驗組相同。
圖1
大鼠LFS示意圖
Figure1.
Diagram of rats under LFS
1.3 SWM行為學任務
基于食物獎勵的T迷宮延遲選擇交替任務，是一種測試SWM的行為學實驗范式[23]，廣泛應用于腦認知活動評估。本研究使用的“T迷宮”由一個起始臂（臂端為起始區域）和兩個具有食物獎勵的目標臂（臂端有固定食槽，可放置食物作為獎勵）組成，如圖2所示。
圖2
T迷宮延遲交替任務示意圖
Figure2.
Diagram of the delayed-alternation task on T-maze
T迷宮任務，包括訓練階段和測試階段。訓練階段，大鼠接受訓練（20次/d）至正確率達到“學會”標準。過程簡述如下：每次任務包括自由選擇和延遲交替選擇兩個過程。在自由選擇過程中，大鼠從起始區域出發至行為選擇參考點（reference point，RP）進行選擇，然后向左或向右移動進入任意一個目標臂以獲得食物獎勵。隨后大鼠返回起始區域，并在等待5 s后，開始延遲交替選擇過程，即大鼠必須選擇與自由選擇過程中相反的目標臂，才能獲得食物獎勵，并記錄為行為學正確；反之，則記錄為錯誤。之后，大鼠自主回到起始區域，本次任務結束。當大鼠行為學正確率連續2 d超過80%時，被認為達到“學會”的標準，完成訓練階段。隨后進行測試階段，過程與訓練階段相同，執行5 d（20次/d）。
1.4 數據處理與分析
應用在體多通道電生理記錄系統OmniPlex 128（Plexon Inc.，美國）記錄不同頻率LFS實時作用時的LFPs，以及T—迷宮任務測試階段的LFPs，并隨機選取每只大鼠20次行為學正確的數據進行分析。對于LFPs數據，首先通過小波（coif5）變換去除基線漂移，并通過陷波濾波器消除50 Hz工頻干擾。使用數學分析軟件Matlab 9.1（MathWorks Inc.，美國）函數庫中的韋爾奇功率譜方法（Pwelch）計算信號的功率譜密度（power spectral density，PSD），以分析其活動強度，使用500 ms時間窗口和50%重疊。
采用PAC方法測量慢節律（θ）相位和快節律（γ）幅值之間的耦合模式，并通過調制指數（modulation index，MI）（以符號MI表示）的方法[24]進行計算，過程簡述如下：首先使用一組窄帶濾波器分別檢測θ振蕩相位的上升和下降斜率，并使用寬帶濾波器找到波谷和波峰，以消除慢節律信號相位因單調變化而形成的偽耦合現象，并將相位信號標記為φ(t)。然后，將φ(t)的每個周期分為4個相位段，分別對應波峰至波谷的下降以及上升時期，再將每個相位段平均分成4份，則一個相位周期被分為16個相位段。對于γ振蕩，使用一個帶寬固定、且頻率中心在γ節律范圍逐步平移的濾波器進行濾波，其帶寬至少是相位信號頻率的兩倍。由于HPC中的主要θ節律振蕩約為8 Hz，帶寬應至少為16 Hz，本研究選取的帶寬為20 Hz，符合兩倍的要求。然后利用希爾伯特變換計算γ振蕩的幅值包絡，記為A(t)。
接下來，計算每個相位段對應γ振蕩包絡Ay的平均值。將各相位段所求的Ay除以各相位段均值的總和，從而將幅值信息轉化為分布概率的信息，如式(1)所示：
|
式中，Ay(j)表示相位段j處的γ幅值包絡Ay的平均值，Pj為Ay(j)的分布概率，N為相位段的個數。當各個相位段所對應的幅值均值相同時，此分布為均勻分布。應用標準化熵度量H來表征調制結果，定義如式(2)所示：
|
當Pj = 1/N時，H達到最大值，記為Hmax。通過標準化，可以得到基于熵的MI。本研究使用MI來表示信號間的PAC強度，如式(3)所示：
|
當MI接近0時，表示相位和幅值的耦合強度較低；MI較大時，表示存在較高強度的耦合。
1.5 統計分析
本研究共記錄了10只大鼠的200次任務，平均每只大鼠20次。應用統計軟件GraphPad Prism 9.0（GraphPad Prism Software Inc., 美國）的單因素方差分析（one-way ANOVA）來分析LFS實時作用結果中的統計學意義；應用t檢驗分析實驗組和對照組之間的差異，以判斷是否具有統計學意義。文中數據均以均值±標準誤表示，檢驗水準為0.05。
2 結果
2.1 不同頻率LFS實時作用的夾帶效應
為探究不同頻率LFS對大鼠高階認知腦區的夾帶效應，本研究分析了大鼠HPC和mPFC腦區的LFPs在受到20、40、60 Hz頻率LFS實時作用時的功率變化，并使用PSD表示。如圖3所示，為大鼠HPC和mPFC腦區LFPs對應刺激頻率處的PSD變化，圖3中黑色曲線表示靜息態，紅色表示各頻率LFS作用，藍色表示偽刺激，陰影為標準差。相比靜息態和偽刺激，LFPs分別在20 Hz—LFS和40 Hz—LFS作用時，對應頻率LFPs的PSD出現尖峰；而60 Hz—LFS作用時，則沒有出現尖峰。提示，20 Hz和40 Hz的刺激頻率可能會在HPC和mPFC腦區形成夾帶效應，而60 Hz的刺激頻率則不會。
圖3
對應刺激頻率LFPs的功率譜密度變化
Figure3.
PSD changes of LFPs at corresponding stimulus frequencies
如圖4所示，為大鼠HPC和mPFC神經振蕩對應頻率處PSD在LFS實時作用下的統計結果。
圖4
靜息態、LFS和偽刺激狀態下對應刺激頻率LFPs的功率譜密度對比（*P < 0.01）
Figure4.
Comparison of PSD of LFPs at corresponding stimulus frequencies in resting, light flicker stimulating and pseudo-stimulating states (*P < 0.01)
（1）20 Hz—LFS實時作用結果顯示，HPC腦區20 Hz節律振蕩的PSD在三種狀態下的差異具有統計學意義［F（2，147）= 65.99，P < 0.01）］，LFS時的PSD高于靜息態（t = 9.72，P < 0.01）和偽刺激（t = 10.16，P < 0.01），差異具有統計學意義，靜息態與偽刺激的差異無統計學意義（t = 0.43，P > 0.99）；mPFC腦區PSD的差異也具有統計學意義［F（2，147） = 75.01，P < 0.01］，LFS時的PSD高于靜息態（t = 10.75，P < 0.01）和偽刺激（t = 10.46，P < 0.01），差異具有統計學意義，靜息態與偽刺激的差異無統計學意義（t = 0.29，P > 0.99）。
（2）40 Hz—LFS實時作用結果顯示，HPC腦區40 Hz節律振蕩的PSD在三種狀態下的差異具有統計學意義［F（2，147） = 62.75，P < 0.01］，LFS時的PSD高于靜息態（t = 10.20，P < 0.01）和偽刺激（t = 9.11，P < 0.01），差異具有統計學意義，靜息態與偽刺激的差異無統計學意義（t = 1.09，P = 0.826）；mPFC腦區PSD的差異也具有統計學意義［F（2，147） = 70.88，P < 0.01］，LFS時的PSD高于靜息態（t = 10.88，P < 0.01）和偽刺激（t = 9.63，P < 0.01），差異具有統計學意義，而靜息態與偽刺激的差異無統計學意義（t = 1.24，P = 0.647）。
（3）60 Hz—LFS實時作用結果顯示，HPC腦區40Hz節律振蕩的PSD在三種狀態下的差異無統計學意義［F（2，147） = 0.45，P = 0.826］，同時mPFC腦區的差異也不具有統計學意義［F（2，147） = 0.25，P = 0.779］。
結果提示，20 Hz—LFS和40 Hz—LFS均能夠明顯增強對應頻率處的PSD，即能夠在大鼠的HPC和mPFC腦區形成夾帶效應。
基于θ、γ節律與SWM的密切關系[18-19]，進一步分析不同頻率的LFS實時作用對θ、γ節律PSD的影響，包括θ（4～12 Hz）、低頻γ（low-frequency γ，lγ）（30～60 Hz）和高頻γ（high-frequency γ，hγ）（60～100 Hz）節律，結果如圖5所示。
圖5
靜息態和不同頻率LFS作用時各節律振蕩功率譜密度的對比（*P < 0.01）
Figure5.
Comparison of PSD of oscillations in various rhythms at resting state and LFS with different frequencies (*P < 0.01)
HPC腦區lγ節律PSD的組間差異具有統計學意義［F（3，196） = 142.70，P < 0.01］，40 Hz—LFS作用時高于靜息態（t = 17.03，P < 0.01）、20 Hz—LFS（t = 15.98，P < 0.01）和60 Hz—LFS（t = 17.53，P < 0.01），差異具有統計學意義；θ和hγ的PSD統計結果顯示組間差異不具有統計學意義［θ：F（3，196） = 1.98，P = 0.118；hγ：F（3，196） = 2.03，P = 0.111］。mPFC的結果與HPC類似，lγ節律PSD的組間差異具有統計學意義［F（3，196） = 34.75，P < 0.01］，40 Hz—LFS作用時高于靜息態（t = 9.13，P < 0.01）、20 Hz—LFS（t = 6.96，P < 0.01）和60 Hz—LFS（t = 8.33，P < 0.01），差異具有統計學意義；θ和hγ的PSD統計結果則顯示組間差異不具有統計學意義［θ：F（3，196） = 0.51，P = 0.673；hγ：F（3，196） = 1.01，P = 0.387］。結果提示，40 Hz—LFS能夠顯著增強HPC和mPFC腦區lγ節律神經振蕩的活動功率。
2.2 40 Hz—LFS長期作用對大鼠T迷宮行為表現的影響
為探究長期40 Hz—LFS對SWM功能的影響，本研究通過T迷宮延遲交替選擇任務檢測了大鼠在40 Hz—LFS作用7 d后的SWM行為表現。首先，統計訓練過程中大鼠每天的正確率，以及滿足行為學標準（如“1.3小節”中所述，至少連續兩天正確率超過80％）所需要的天數。結果如圖6所示，隨著訓練天數的增加，正確率呈逐漸上升趨勢，且各組大鼠在經過訓練之后均滿足行為學標準，數據以均值±標準差表示。實驗組滿足行為學標準的平均時長［t=(4.00 ± 0.32) d］少于對照組［t=(6.28 ± 0.51) d］，差異具有統計學意義（t = 4.00，P < 0.01）。結果表明，實驗組大鼠需要較少的時間和訓練就能夠學會相同的任務，反映出其SWM功能得到改善。
圖6
大鼠T迷宮延遲交替選擇任務行為表現
Figure6.
Behavior performance of rats in T-maze delayed alternative choice task
2.3 40 Hz—LFS長期作用對大鼠HPC—mPFC回路PSD的影響
為探究40 Hz—LFS長期作用改善大鼠SWM行為表現的神經機制，本研究分析了實驗組和對照組大鼠HPC和mPFC腦區神經振蕩在靜息狀態下的活動變化，結果如圖7所示。所有節律的PSD在兩組數據中的差異均無統計學意義（P > 0.05）。該研究結果提示，40 Hz—LFS長期作用并沒有改變大鼠靜息狀態下HPC和mPFC腦區40 Hz神經振蕩的活動強度。
圖7
兩組大鼠各節律振蕩的功率譜密度對比
Figure7.
Comparison of PSD of oscillations in various rhythms between two groups of rats
2.4 40 Hz—LFS長期作用對大鼠HPC—mPFC回路PAC機制的影響
選取大鼠T迷宮任務延遲交替過程中關鍵時期[25-26]的LFP數據（RP前1 s的決策時期）進行分析，以探索兩組大鼠的PAC模式變化。如圖8所示，為大鼠HPC—mPFC回路的PAC模式示意圖，橫軸代表θ相位的頻率，縱軸為γ幅值的頻率，PAC強度用MI表示，顏色越接近紅色表示MI越高。由圖8可見，在γ節律之間發現不同的耦合峰值，表明γ節律范圍內可能存在不同的耦合模式。為此，將γ節律范圍分為lγ（30～60 Hz）和hγ（60～100 Hz），分別統計其與θ相位之間的耦合強度。
圖8
大鼠HPC—mPFC回路的PAC模式示意圖
Figure8.
PAC pattern of the HPC-mPFC circuit in rats
如圖9所示，為兩組大鼠的MI對比結果。其中，實驗組HPC（θ）—mPFC（lγ）的MI高于對照組，差異具有統計學意義（t = 2.54，P = 0.016）。同時，mPFC（θ）—HPC（lγ）的MI結果也顯示實驗組高于對照組，差異具有統計學意義（t = 2.63，P = 0.012）。而兩組MI在HPC（θ）— mPFC（hγ）（t = 0.17，P = 0. 868）和mPFC（θ）—HPC（hγ）（t = 1.29，P = 0.204）的差異無統計學意義。研究結果提示，40 Hz—LFS長期作用能夠增強大鼠HPC—mPFC回路θ—lγ之間的PAC強度。
圖9
兩組大鼠HPC—mPFC的MI對比
Figure9.
MI comparison of HPC-mPFC between two groups
3 討論
本研究通過分析不同頻率LFS實時作用在HPC和mPFC腦區形成的夾帶效應，以及40 Hz—LFS長期作用后，大鼠執行T迷宮任務的行為表現與HPC—mPFC回路θ—γ節律的PAC模式，從不同節律神經振蕩協同作用的角度，探究了40 Hz—LFS影響大鼠SWM功能的神經機制。結果發現，40 Hz—LFS實時作用能夠顯著增強lγ節律的振蕩活動，對HPC和mPFC腦區形成有效的夾帶效應，達到調控神經振蕩目的。Adaikkan等[10]的研究也表明，40 Hz—LFS能夠有效夾帶視覺皮層以及HPC等高階腦區的γ節律，增強γ節律振蕩活動的功率，與本研究的結果一致。此外，本研究還發現60 Hz—LFS沒有表現出明顯的夾帶效應，可能的原因是，視覺誘發的神經振蕩響應在大腦空間傳播時對刺激頻率很敏感，頻率較高時（>54 Hz）更多地集中在視覺皮層[27]，并沒有傳輸到HPC和mPFC等腦區。Lee等[28]還報道了節律性LFS對人體進行刺激時，頻率為34～38 Hz的白光能夠同步人體大腦中更強且范圍更廣的γ振蕩。這些研究表明，節律性LFS在包含40 Hz的低頻γ節律范圍內可能比在高頻γ節律范圍更適合夾帶效應。盡管這種基于LFS的物理刺激模式能夠有效增強神經振蕩活動強度，調控大腦皮層神經活動，但仍需對刺激模式進一步優化，如結合聲音和不同顏色的光（如藍光和紅光等），以達到更好的刺激效果。
本文大鼠行為學結果表明，相比未受刺激的對照組，經過40 Hz—LFS的實驗組大鼠達到T—迷宮任務標準所需的天數較少，即SWM功能得到改善。而之前的研究也報道了，40 Hz—LFS能夠有效改善實驗動物莫里斯水迷宮等SWM任務的表現[9-10]，與本研究結果一致。此外，相關研究還從分子蛋白水平探究了可能的作用機制，結果表明40 Hz—LFS長期作用能夠有效降低AD模型小鼠的Aβ和微管相關蛋白（tubulin-associated unit，tau）水平[4]，減少小膠質介導的炎癥應答[9]，增強相關基因和蛋白質的表達[11]，促進神經元中突觸傳遞和細胞內轉運[12]，從而起到神經保護作用[10]，達到改善AD的效果。這些結果都為促進40 Hz—LFS的發展提供了支持，然而在臨床應用中，這種非藥物性的療法仍然是一個相對較新的研究領域，仍需進一步開發其潛在的治療效果[29-30]，為將來治療AD提供一種可能的選擇。
由于LFPs可以直接反映神經元集群的電生理活動，因此研究LFPs特征對探究神經系統認知功能的作用機制具有重要意義。本研究發現，40 Hz—LFS長期作用沒有對靜息態的神經振蕩活動造成影響，而是提高了大鼠T迷宮任務過程中HPC和mPFC腦區θ—lγ的PAC強度，表明40 Hz—LFS加強了HPC—mPFC回路不同節律神經振蕩的協同作用。有研究表明，不同節律神經振蕩之間的PAC可能是大鼠執行認知任務的關鍵神經機制，尤其是HPC和mPFC腦區的PAC在大鼠的認知任務活動中有效編碼了SWM[13, 18, 25]。Tort等[25]和Wang等[26]的研究表明，PAC峰值出現在T迷宮任務RP附近的決策期間，反映出PAC在不同時間尺度上主動參與認知任務的動態過程，體現了PAC在編碼認知任務中的神經作用機制。此外，本研究還發現θ相位與多個γ子節律幅值發生了耦合，可能是由于不同的γ子節律范圍具有獨立的生理意義，并在WM過程發揮不同的功能。具體而言，40 Hz—LFS長期作用顯著增強了θ—lγ的PAC強度，對θ—hγ無明顯影響，可能的原因是40 Hz—LFS長期刺激對lγ節律振蕩的活動強度有增強效果，進而加強了與θ節律的耦合作用，但并沒有對hγ產生作用。結合大鼠SWM行為學結果，本研究結果提示，θ—lγ的PAC上升引起的HPC—mPFC回路神經信息協同作用增強，可能是40 Hz—LFS改善大鼠SWM任務行為表現的神經機制。然而，本研究也存在樣本量較少、刺激時長不完善等局限性，故尚需進一步完善相關研究內容。
4 結論
本研究基于在體多通道電生理記錄系統OmniPlex 128（Plexon Inc.，美國）實時分析了大鼠HPC和mPFC腦區在不同頻率（20、40、60 Hz）LFS實時作用時的夾帶效應，隨后進行40 Hz—LFS長期作用，并通過T迷宮延遲交替任務評估大鼠的SWM表現，同時計算了HPC—mPFC回路θ—γ節律的PAC強度。結果表明，40 Hz—LFS實時作用表現出明顯的夾帶現象，能夠顯著增強lγ節律振蕩的活動功率；長期作用則顯著改善大鼠SWM任務行為表現，增強其認知水平，提高HPC—mPFC回路θ—lγ的PAC強度，加強不同節律振蕩以CFC方式進行的跨腦區協同作用。
綜上，本研究結果表明40 Hz—LFS長期作用有效增強了大鼠HPC—mPFC回路θ—lγ的PAC強度，促進了不同節律振蕩在腦區間的協同作用，進而改善了大鼠的SWM功能，為今后研究40 Hz—LFS改善認知功能的機制及促進其臨床應用提供了支持。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：作者王龍龍參與了論文的選題、實驗設計、數據采集和分析、論文寫作；作者李雙燕和徐桂芝參與了論文的選題、實驗設計、論文內容審核和論文修改；作者李潤澤參與了數據采集、分析和論文修改。
倫理聲明：本研究所有實驗步驟環節均已通過了河北工業大學生物醫學倫理委員審查（審查編號：HEBUTaCUC2022052）。
